在實驗的過程中經(jīng)常會遇到保留時間不穩(wěn)定的問題，我們也總接觸到相關(guān)問題的技術(shù)咨詢。我們的技術(shù)工程師深知大家的痛點，特根據(jù)大家的反饋，梳理了一個從發(fā)現(xiàn)問題到處理問題的解決思路。以后再遇到保留時間不穩(wěn)定的問題，就可以輕松搞定啦。

保留時間不穩(wěn)定，會是什么問題？

首先要找出變化的模式，

這個會幫助我們找到很多潛在的原因。

#1

保留時間在同一天變化大，

同一瓶流動相，同一根色譜柱，同一臺儀器

1）首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來檢測流速（設(shè)置儀器流速1mL/min，用10ml量筒收集流出液10分鐘，應(yīng)該得到液體約10ml±0.5ml，量筒有誤差，使用的試劑與儀器廠家標(biāo)定泵流速時試劑不一樣，最終體積也有些差異，如果超過這個范圍，再分開通道檢測，以找到流速不正確的原因，并排除）；

2）檢查流動相組成是否變化，可以在流動相中加入跟蹤劑來觀察基線的變化，例如：反相條件，UV檢測器，在有機(jī)相中加入0.1%丙酮，監(jiān)測254nm下的基線變化，還有一種方法人工配制流動相，然后通過混合器，這時候保留時間穩(wěn)定了，不再波動，那就是混合器工作不正常，或者混合不均勻，進(jìn)行排除。

#2

保留時間一天之內(nèi)正常，不同天數(shù)之間變化

1）儀器本身不太可能有問題，可能是流動相的組成變化引起的，在反相色譜中，保留因子k和流動相中的有機(jī)溶劑的體積含量成指數(shù)關(guān)系，根據(jù)經(jīng)驗，如果有機(jī)溶劑含量誤差在1%，那保留時間的變化在5%-15%之間，大部分變化在10%左右，意味著用稱量有機(jī)溶劑的方式配置流動相能得到更穩(wěn)定的保留時間；

2）流動相的脫氣方式也可能導(dǎo)致，最好的脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鐘左右，非真空條件下超聲脫氣5分鐘，這樣會最大程度的減少溶劑的揮發(fā)，還有一種方法是流動相中通過氦氣，流動相被氦氣平衡后，氦氣流立刻關(guān)閉，避免氦氣帶走溶劑蒸汽，而導(dǎo)致溶劑組成改變；

3）流動相的抽濾方式，通常情況下，如果我們使用有機(jī)溶劑和水相混合流動相時，會先將流動相配置混勻好后，再進(jìn)行抽濾，這樣的好處是流動相混合更均勻，但是對于流動相中沸點較低的部分，在抽濾過程中會損失更大，導(dǎo)致流動相溶劑組成改變，建議有機(jī)相和水相分開抽濾，再進(jìn)行混合，超聲脫氣；

4）檢測目標(biāo)物是離子狀態(tài)或者離子化的，那么控制流動相的pH就非常重要，就算是0.1單位pH的變化都有可能導(dǎo)致保留時間漂移10%左右，所以準(zhǔn)確稱量pH值并保證pH儀被很好的校正了，在反相色譜柱中，隨著pH值的升高，酸的保留會減少，堿的保留會增加。

反相色譜中，分離離子或離子化的樣品，保留時間會受到正確緩沖溶液的離子強(qiáng)度的影響，但影響會很小，可以不計，典型狀況是緩沖鹽的摩爾數(shù)改變20%，保留時間的變化是1%，緩沖鹽的組成通常是稱量的，那么大的誤差是不會發(fā)生的。

#3

保留時間漂移

還有影響保留時間的一個重要問題就是保留時間漂移（一直延長或一直縮短）。

1）大部分工作者認(rèn)為漂移是平衡的問題，如果使用的是未修飾硅膠柱做正相色譜，這是最有可能的原因，使用半飽和流動相改善。反相色譜中，平衡通常會很快，5-10個柱體積的流動相通常就足夠平衡了，但不全是如此，典型的就是離子對色譜中，使用離子對試劑平衡色譜柱，由于離子對試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們要吸附在反相色譜柱填料表面，表面濃度在0.5-2μmol/m²，1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對試劑進(jìn)行完全的柱平衡，流動相濃度為2mmol時，那需要1L流動相進(jìn)行平衡，這個雖然是極端條件，但是用幾百毫升的流動相去平衡色譜柱也是正常的，因此離子對色譜中，使用了有機(jī)溶劑清除了離子對試劑，這樣第二天需要更長的時間平衡色譜柱。這兩個現(xiàn)象都是流動相中有低濃度的強(qiáng)吸附試劑導(dǎo)致的，這是保留時間漂移最常見的原因，也還有別的原因。

2）樣品中含有強(qiáng)吸附劑，在重復(fù)進(jìn)樣中會慢慢累積，從而改變色譜柱的化學(xué)性質(zhì)，如：藥品的賦形劑?？梢酝ㄟ^觀察保留時間變化的速率來得知雜質(zhì)是從流動相中引入還是樣品中引入。實驗如下：

● 進(jìn)樣幾次，如：進(jìn)樣四次，共使用了1個小時；

● 走相同量的流動相，不進(jìn)樣；

● 重復(fù)第一步；

● 做一個關(guān)系圖；

保留時間：▲ 對時間的關(guān)系

                ▲ 對進(jìn)樣次數(shù)的關(guān)系

如果第一個圖得到一條平滑的曲線，那么流動相是引入雜質(zhì)的原因，如果第二個圖得到一條平滑的曲線，那么雜質(zhì)的來源是樣品。

3）鍵合相水解，色譜柱制造商會制定一個pH范圍，超出范圍可能導(dǎo)致鍵合相不穩(wěn)定，然而，很多情況下使用者不得不在接近這個pH極限，但是并沒有一個明顯的分界線，因為水解還取決于其他因素，如：溫度，有機(jī)溶劑，緩沖鹽的濃度和種類，樣品的化學(xué)性質(zhì)等，因此這個水解也可能發(fā)生在這個pH范圍內(nèi)。要保存固定相的水解穩(wěn)定性，最好是在中性pH值（3-5左右）和低溫下。等度條件穩(wěn)定性優(yōu)于梯度條件，在等度條件下發(fā)生水解的過程中，鍵合相通常會發(fā)生自我吸附，并達(dá)成一種區(qū)域平衡，在使用高濃度的有機(jī)溶劑時，在梯度時或者沖洗色譜柱時，這種平衡會被打破，鍵合相被沖出色譜柱。

4）溫度的變化，如果樣品是自動分析過夜或者過了周末，那保留時間的漂移可能和實驗室的溫度變化有關(guān)，在很多地方，室溫的設(shè)置在晚上或者周末是不一樣的，一般來講，1℃的變化導(dǎo)致保留時間的漂移大約在1%到2%。這個可以聯(lián)系最后一個導(dǎo)致保留時間漂移的原因--柱壓的增加，柱壓的異常升高，表明色譜柱被污染，僅僅是篩板被堵塞就可能導(dǎo)致保留時間漂移，這是因為，為了使流動相通過篩板，需要額外的壓力來促使流動相通過篩板，這會使流動相在摩擦的過程中受熱，從而導(dǎo)致保留時間的漂移。

5）反相色譜鍵合相發(fā)生了“相塌陷”，由于流動相中有機(jī)溶劑比例太少，高鍵合覆蓋率、“完全封端”的C18沒有很好的被流動相浸潤，這會使得流動相和固定相沒有很好的接觸，造成鍵合相卷曲，固定相之間相互吸附，從而導(dǎo)致固定相可以和樣品相互作用的表面積減少，使得保留時間逐漸變短。這時候立即用一定量的有機(jī)溶劑（建議40%乙腈水）沖洗色譜柱可以使鍵合相恢復(fù)，這種現(xiàn)象在短鏈烷烴結(jié)合，未封尾的反相鍵合相上則很少發(fā)生，或者是不發(fā)生。

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