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通過實驗室離心機采用差速離心法來分離細胞內的各種成分,從而到達了解細胞核和線粒體并進行鑒定的目的。
離心是一種利用旋轉運動的離心力以及物質的沉降系數或浮力密度的差異進行分離、濃縮和提純的方法。實驗室離心機的離心技術已在細胞分離實驗過程中廣泛應用。進行細胞培養(yǎng)時,常規(guī)需要進行制備細胞懸液、調整細胞密度、洗滌、收集細胞等工作,通常需要使用實驗室離心機。一般可常規(guī)配置4000rpm的國產臺式離心機,例如細胞沉降,使用低速離心機即可,離心力過大有時可能引起細胞的損傷。
分離純化的方法有2種:主要包括差速離心、密度梯度離心等。
差速離心:差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞。開始離心的速度較低,讓較大的顆粒沉降到管底,小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀,改用較高的離心速度離心懸浮液,將較小的顆粒沉降,以此類推,達到分離不同大小顆粒的目的。
密度梯度離心:當顆粒之間存在沉降系數差時,在一定的離心力作用下,顆粒以一定速度沉降在不同的密度梯度區(qū)域中形成區(qū)帶的方法。
用兩種濃度的蔗糖溶液制成的梯度,離心機離心后,線粒體和比它沉降系數小的細胞成分聚集在梯度交界處,而沉降系數較大的細胞組分沉到離心管的底部。
動物肝細胞勻漿制備實驗:
(1)取出肝臟(2g左右),先用清水沖洗干凈后,放在置于冰塊上的培養(yǎng)皿中用剪刀剪成小塊,去除結締組織,用生理鹽水反復洗滌,盡量除去血污,用濾紙吸去表面的液體。
(2)加入10mL預冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化鈣溶液
(3)將懸浮的肝組織液倒入組織搗碎機中進行搗碎,直至沒有可見的組織塊為止。
(4)將肝組織搗碎液分裝在50ml離心管中,實驗室離心機1500rpm 4°下離心2min (去除大組織塊)。
常用介質(高溶解性的惰性物質):氯化艷、蔗糖、多聚蔗糖。
在整個實驗過程中除了按規(guī)定操作外,要格外注意離心機的使用安全,并盡可能的充分分割肝組織,縮短勻漿時間,整個分離過程不宜過長,以保持組分生理活性。
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