高效液相色譜法方法開發(fā)技巧之找到目標峰

在液相色譜方法開發(fā)的過程中，一個總的原則是：先找到目標峰，然后調整峰形和分離，再進一步完善。

找到目標峰，如果是已知目標化合物，可通過標準品來進行確定。如果是未知復雜樣品，則需要根據(jù)自己實驗的目的和樣品本身來進行判斷。在不了解樣品信息的情況下，通常最好選擇C18柱作為初始的選擇。因為C18柱使用最多，手頭上一般都會有現(xiàn)成的柱子可嘗試，而且C18的保留機理也最為簡單，我們對它的保留性能最了解和最熟悉的，通過樣品在C18柱上的獲得的信息，我們可以預測其極性等性質，方便調整實驗方法。

找到目標峰說起來很簡單，實際上在實驗過程中還是經常會碰到很多的問題，例如，峰沒有

1.
峰沒有保留
在碰到峰沒有保留這種情況的時候，首先可以先調整一下流動相的洗脫強度，降低流動相的洗脫能力，下表列出了在各種色譜模式下，如何改變溶劑的洗脫能力，可參照這個表格進行調整。

下圖為一個通過調節(jié)流動相洗脫能力，增強化合物保留的例子。隨著流動相中乙腈比例的降低，目標化合物的保留隨之增強，且達到基線分離的效果。

如果調整了流動相洗脫能力之后保留還是沒有改善，則可以通過改變流動相條件或者更換其他的固定相或者對樣品進行衍生化處理等進行調整。

例如對于酸性或堿性化合物，改變流動相的pH值，使得目標化合物在流動相中呈中性狀態(tài)，可以增加目標化合物的保留；還可以在流動相中添加相應的離子對試劑，以增強保留。另外還可以考慮更換固定相，如換成具有極性選擇性的高碳載量的反相C18柱；或采用離子交換或者HILIC模式進行分離。

對于中性化合物，則更多需要考慮更換固定相，如具有極性選擇性的高碳載量的反相C18柱；或者選擇HILIC模式或正相分離的模式進行分離。

對于兩性化合物，如氨基酸之類的樣品，還可以考慮對樣品進行衍生化處理，以增強在固定相上的保留。

2.
沒有出峰

在碰到樣品沒有出峰的情況，首先考慮是否是因進樣濃度太小，運行時間不夠，儀器和色譜柱故障，樣品是否降解變質，檢測器（檢測波長）的選擇是否準確等問題導致的。如果排除上述問題，樣品仍未出峰，則很有可能是樣品在固定相上保留太強，這樣可以先調整流動相的洗脫能力，增強對化合物的洗脫，或者更換更合適的固定相，如反相C18換成碳載量低一些的C18或者短碳鏈的反相柱如C8等。

3.
有其他雜峰干擾

如果碰到有其他峰干擾的情況，可以先做一個空白實驗，排除試劑、色譜柱和儀器系統(tǒng)污染或梯度變化等導致的空白雜峰的干擾。（TIPs：空白實驗應該如何做呢？除不加樣品之外，采用完全相同的樣品處理、分析步驟、試劑和用量，進行平行操作。在這里建議大家在做完空白實驗之后，再進幾針樣品來做進一步判斷。）排除空白干擾之后，如果還無法判斷目標峰的位置，對于已知化合物，通?？赏ㄟ^標準品來確定出峰的位置；對于未知樣品的復雜樣品，可以根據(jù)自己的實驗目的，考慮樣品是否需要制備純化，再通過其他分析鑒定對樣品中各組分進行其他定性定量分析（如紅外，質譜，核磁等）。

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